首页  - 》 

黄曲霉素的测定方法
来源: | 作者:pro79c3ec | 发布时间: 2013-09-07 | 12191 次浏览 | 分享到:
黄曲霉毒素的毒性是已知100余种霉菌毒素中毒性最大的毒物之一

1960年,英国发生了“火鸡X病”事件。为此,科学家经研究发现了黄曲毒霉素。之后,有关黄曲霉毒素的研究迅速开展,黄曲霉毒素也因此而成为迄今研究最多、结论最为清楚的一类真菌毒素。

 

黄曲霉毒素藏在哪儿    

 

在世界范围内,黄曲霉毒素的污染普遍存在,尤其是在气候温热地区污染更加普遍。黄曲霉毒素能污染多种农作物,包括多种谷物,如玉米、大米、小麦、高粱等;油料作物,如花生、大豆、棉籽等;各种坚果,如无花果、核桃、杏仁等;各种香料,如辣椒和姜等。其中最易受污染的农作物是玉米、花生和棉籽。

 

黄曲霉毒素致癌证据确凿

 

动物试验表明,黄曲霉毒素能诱发动物肝癌,也能诱发胃、肾、直肠、乳腺、卵巢和小肠癌。在各种黄曲霉毒素中,AFB1是迄今发现的作用最强的致癌物。它比二甲基亚硝胺诱发肝癌的作用力大75倍,是34苯并芘的4000倍。在过去的25年中,亚洲和非洲进行的流行病学研究揭示,黄曲霉毒素的摄入和原发性肝癌的发病率显著相关。因此,国际癌症研究机构已将AFB1列为人类致癌物。但由于这种致癌物不存在一个绝对安全的剂量,即使再低的剂量也有可能引起基因损伤,而这种损伤经过积累就可能导致癌症,因此国际上未制定安全摄入量。

 

基因毒性:黄曲霉毒素的致癌绝招    

 

黄曲霉毒素是目前已知的作用最强的基因毒性物质之一,它在许多模型系统中都能引起细胞突变。除了能在啮齿类动物和人体细胞内形成加合物以外,黄曲霉毒素还能导致染色体异常、染色体链断裂和DNA合成紊乱等。

 

现已确定,AFB1N7-鸟嘌呤是黄曲霉毒素在细胞内形成的主要加合物;在所有被检测的物种中,哪怕是在低剂量范围内,细胞突变都与它呈正相关;肝脏是AFB1最重要的靶器官,含量最高;P53基因的249密码子是最易受AFB1攻击产生突变的位点,在亚洲和非洲,肝癌患者的P53基因突变率很高。

 

拒绝黄曲霉毒素:减少摄入    

 

人类减少黄曲霉毒素摄入的主要方法是控制食物污染。

 

1、采取一定的去毒措施。由于霉菌及其毒素污染在生产上存在不可避免性,因此需要从生产加工工艺上采取一定的去毒措施,设法减轻产品中黄曲霉毒素的污染。

 

2、实施食品或饲料的黄曲霉毒素限量标准。为了减少人类摄入黄曲霉毒素,全世界包括我国在内的很多国家,都制定了食品或饲料中黄曲霉毒素的限量标准,并采取了一些措施来保证这些标准的实施。

 

 

     中国疾控中心营养与食品安全所研究员计融

         资料来源:健康报网

 

 

黄曲霉素是一种有荧光的毒素。在紫外线照射下,能发生蓝紫色、绿色的闪闪荧光。目前,化学结构已确定BIB2G1G2等十几种。产生黄曲霉素主要菌种是黄曲霉和寄生曲霉,此外,还有曲霉、青霉、根霉等。各种黄曲霉素的相对分子质量为312346,熔点200300℃。黄曲留素Bl在水中溶解度很小,最大溶解度只有10mg/L。黄曲霉索分布范围很广,凡是受到能产生黄曲霉素霉菌污染的粮食、食品和饲科都可能存在黄曲霉素。如被人和动物食用,就会造成黄曲霉素中毒。 

 

黄曲霉素是一种剧毒物和强致癌物质。黄曲霉素BlG1,可诱发肝癌和皮下肉瘤。黄曲霉素对动物的肝、肾、大脑和神经系统等引起病变。北京医学院用含20μgkg的黄曲霉素饲料,饲养大白鼠1年后,即发生肝癌的多种器官肿瘤。国外报道,黄曲霉素含量在1μkg可诱发癌症。1μg /kg黄曲霉素含量相当于1t粮食中只有一粒芝麻大的黄曲霉素。1974年印度西部曾暴发一次流行肝炎,患者397人,死亡106人,其原因是由于居民吃了因下雨而发霉的玉米,受黄曲霉素污染的结果。主要中毒症状为恶心、呕吐、黄疽、肝区疼痛、胃肠大出血而死亡。黄曲霉素是迄今发现的各种真菌毒素中最稳定的一种。结晶的黄曲霉素BI,耐强酸和紫外线照射,加热到268269℃时开始分解破坏。对于这种毒素,最好的防治方法是预防粮食等食物的霉变。消除毒素的主要方法是加碱破坏素。         

 

黄曲霉素为分子真菌毒素。我国规定大米、食用油中黄曲霉毒素允许量标准为10ug/Kg,其他粮食、豆类及发酵食品为5ug/Kg。婴儿代乳食品不得检出。而世界卫生组织推荐食品、饲料中黄曲霉毒素最高允许量标准为15ugkg3050ugkg为低毒,50100ugkg为中毒,1001000ugkg为高毒,1000ugkg以上为极毒。,其毒性为氰化钾的10倍,为砒霜的68倍。此外,黄曲霉毒素有很强的致癌性

 

 

黄曲霉素是目前发现的化学致癌物中最强的物质之一。它主要引起肝癌,还可以诱发骨癌、肾癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌等。         

 

黄曲霉素主要存在于被黄曲霉素污染过的粮食、油及其制品中。例如黄曲霉污染的花生、花生油、玉米、大米、棉籽中最为常见,在干果类食品如胡桃、杏仁、榛子、干辣椒中,在动物性食品如肝、咸鱼中以及在奶和奶制品中也曾发现过黄曲霉素。 

 

 

 

 

 

 

其中最危险的是黄曲霉毒素B(黄曲霉毒素的异构体中毒性最强的一种),它主要诱发肝癌,同时还能诱发胃癌、肾癌、直肠癌及使乳腺、卵巢、小肠等部位发生癌变。由于黄曲霉毒素产生的条件是25℃~29℃,相对湿度是85%以上,所以我市生产的花生、玉米、花生油、大米、棉籽油等,如果贮存不当,最易生长能够产生黄曲霉毒素的黄曲霉菌、寄生曲霉菌等;其次是小麦、大麦;家庭自制的面酱等发酵食品有时也会被污染;咸肉、火腿、香肠等肉类食品,也有受到污染的可能。黄曲霉毒素具有耐热的特点,在一般的烹调加工温度下破坏很少,即使是200℃高温加热,也不能完全破坏,在280℃时才发生裂解。预防的办法主要是防止粮油食品霉变,已发生霉变的食品则不要食用,轻度污染的可采取适当方法去毒。

 

控制粮食的含水量,是防止黄曲霉毒素对粮食污染的关键性措施。粮食收获时要迅速干燥,特别是在温湿度较高的霉雨季节,最易污染黄曲霉毒素。粮食贮藏时,要合乎防霉含水量的要求,而且要注意通风防潮,并尽可能保持皮壳完整,使霉菌不易侵入。有条件的地方还可以考虑低温贮藏,或在贮藏空间充以惰性气体。花生在贮存之前须充分晒干,而且要进行挑选,将一些霉粒、皱皮、破粒及虫蛀的颗粒剔除,贮存中注意经常出仓凉晒。在家庭中,对于发霉程度较轻的粮食可以通过碾轧加工或淘米时搓洗等办法处理,以降低黄曲霉毒素的含量。对于发霉不重的植物油,可用加碱或加入活性炭等方法,来破坏、吸收植物油中的黄曲霉毒素。对于霉变较重的食品,不要食用,也不能用霉变而又未经处理去毒的粮食、饲料饲喂家禽家畜,否则通过食物链会引起人的食物中毒。研究证明,牛奶中如含有黄曲霉毒素,往往是奶牛食了受污染饲料的结果。由于黄曲霉毒素有剧毒,世界上许多国家(包括我国)都对黄曲霉毒素在有关食品中的允许含量作了法律规定,因此加强食品中黄曲霉毒素的监测,乃是刻不容缓的任务。

 

食品中黄曲霉毒素B1的测定方法        代替GB/T 5009.22-85

Method for determination of aflaloxin B in foods

------------------------------------------------------------------------------------------------------------

        1主题内容与适用范围

        本标准规定了粮食、花生及其制品、薯类、豆类、发酵食品及酒类等各种

食品中黄曲霉毒素B1的测定方法。

        本标准适用于粮食、花生及其制品、薯类、豆类、发酵食品及酒类等各种

食品中黄曲霉毒素B1的测定。

        本标准分为两法。在第一法中,薄层板上黄曲霉毒索8的最低检出量为0.0004

      μg,最低检出浓度为5μg/kg。第二法对黄曲霉毒素B1的最低检出浓度为0.01

μg/kg

                                        第一篇 第一法

        2原理

        样品中黄曲霉毒素B1经提取浓缩、薄层分离后,在波长365 nm紫外光下产

生蓝紫色荧光,根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。

        3试剂

        31三氯甲烷。

        32正己烷或五油醚(沸程3060℃或6090℃)。

        33甲醇。

        34苯。

          35乙腈。

          36无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水。

          37丙酮。

              以上试剂在试验时先进行一次试剂空白试验,如不干扰测定即可使用,

否则需逐一进行重蒸。

          3硅胶G:薄层色谱用。

          39三氟乙酸。

          310无水硫酸钠。

          31l氯化钠。

312苯-乙睛混合液:量取98 mL苯,加2mL乙睛,混匀。

313甲醇水溶液:5545

3. 14黄曲霉毒素B1标准溶液。

3141仪器校正:测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数,以求出使用仪器的校

正因素。准确称取25 mg经干燥的重铬酸钾(基准级),用硫酸(051000

溶解后并准确稀释至200ml,相当于c(k2cr2o7)=0.0004 mol/L。再吸取25 mL此稀释

液于50 mL容量瓶中,加硫酸(051000)稀释至刻度,相当于00002mol/L

液。再吸取25 mL此稀释液于50 mL容量瓶中,加硫酸(0.51000)稀释至刻度,

相当于00001 mol/l溶液。用1cm石英杯,在最大吸收峰的波长(接近350 nm处)

用硫酸(051000)作空白,测得以上三种不同浓度的摩尔溶液的吸光度,并

按式(l)计算出以上三种浓度的摩尔消光系数的平均值。

                 A

            E----------……………(1

                 C

式中:E一重铬酸钾溶液的摩尔消光系数;

            A——测得重铬酸钾溶液的吸光度;

            c——重铬酸钾溶液的摩尔浓度。

      再以此平均值与重铬酸钾的摩尔消光系数值3160比较,即求出使用仪器的校

正因素。

                                3160

                          f=一一一    ………………(2

                                 E

式中:f——使用仪器的校正因素。

           E——测得的重铬酸钾摩尔消光系数平均值。

         若f大于095或小于105,则使用仪器的校正因素可略而不计。

3.14.2 黄曲霉毒素B1标准溶液的制备:准确称取112mg黄曲霉毒素B1标准品,

先加入2ml乙腈溶解后,再用苯稀释至100 mL,避光,置于4℃冰箱保存。该标准

溶液约为10μg/ml。用紫外分光光度计测此标准溶液的最大吸收峰的波长及该波

长的吸光度值.

3142计算

                   A×M×1000×f

              X1= ---------------  ………………(3

                        E

式中;X1——黄曲霉毒素8标准溶液的浓度,μg/mL

           A——侧得的吸光度值;

           f——使用仪器的校正因素;

           M——黄曲霉毒素B1的分子量3l2 ;

           E一-:黄曲霉毒素B1在苯-乙睛混合液中的摩尔消光系数,19800

        根据计算,用苯-乙睛混合液调到标准溶液浓度恰为10Oμg/mL,并用分光

光度计核对其浓度。

      3143纯度的测定:取5μL 10μg/mL黄曲霉毒素Β1标准溶液,滴加于涂晨

厚度025 mm的硅胶G薄层板上,用甲醇-三氯甲烷(496)与丙酮-三氯甲

烷《892)展开剂展开,在紫外光灯下观察荧光的产生,必须符合以下条件:

      3. 1431在展开后,只有单一的荧光点,无其他杂质荧光点。

      3. 1432原点上没有任何残留的荧光物质。

      315黄曲霉毒素B1标准使用液:准确吸取1mL标准溶液(10μg/mL〕于10 ml

容量瓶中,加苯-乙睛混合液至刻度,混匀。此溶液每毫升相当于10μg黄曲霉

毒素B1吸取10ml此稀释液,置于5ml容量瓶中,加苯-乙睛混合液稀释至刻度,

此溶液每毫升相当于02μg黄曲霉毒素B1.再吸取黄曲霉毒素B1标准溶液(02

μg/mL) l0ml置于5ml容量瓶中,加苯-乙睛混合液稀释至刻度。此溶液每毫升

相当于004μg黄曲霉毒素B1

        3。 16次氯酸钠溶液(清毒用):取100g漂白粉,加入500 mL水,搅拌均匀。

另将80g 工业用碳酸钠(Na2C)310H2O)溶于500 ml温水中,再将两液混合、搅

拌,澄清后过滤。此滤液含次氯酸浓度约为25 g/L。若用漂粉精制备,则碳酸钠

的量可以加倍。所得溶液的浓度约为50 g/l。污染的玻璃仪器用I0g/L次氯酸钠溶

液浸泡半天或用50g/L次氯酸钠溶液浸泡片刻后,即可达到去毒效果。

      4仪器

      41小型粉碎机。

      42样筛。

      43电动振荡器。

      44全玻璃浓缩器。

      45玻璃板:5cmX20cm

      46薄层板涂布器。

      47展开槽:内长25cm、宽6cm、高4cm

        48紫外光灯:100125W,带有波长365 nm滤光片。

        49微量注射器或血色素吸管。

        5分析步骤

      51取样

            样品中污染黄曲霉毒素高的霉粒一粒可以左右测定结果,而且有毒霉粒

的比例小,同时分布不均匀。为避免取样带来的误差,必须大量取样,并将该

大量样品粉碎,混合均匀。 才有可能得到确能代表一批样品的相对可靠的结

果,因此采样必须注意以下几点。

      511根据规定采取有代表性样品。

      512对局部发霉变质的样品检验时,应单独取样。

      513每份分析测定用的样品应从大样经粗碎与连续多次用四分法缩减

051kg,然后全部粉碎。粮食样品全部通过20目筛,混匀。花生样品全

部通过10目筛,混匀。或将好、坏分别测定,再计算其含量。花生油和花生酱

等样品不需制备,但取样时应搅拌均匀。必要时,每批样品可采取3份大样作样

品制备及分析测定用,以观察所采样品是否具有一定的代表性。

      52提取

      521玉米、大米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等。

      5211甲法:称取2000g粉碎过筛样品(面粉、花生酱不需粉碎),

置于250 mL具塞锥形瓶中,加30 mL正己烷或石油醚和100 mL甲醇水溶液,在瓶

塞上涂上一层水,盖严防漏。振荡30 min,静置片刻,以叠成折叠式的快速定性

滤纸过滤于分液漏斗中,待下层甲醇水溶液分清后,放出甲醇水溶液于另一具塞

锥形瓶内。取2000 mL甲醇水溶液(相当于4g样品)置于另一125 mL分液漏斗

中,加20 mL三氯甲烷,振摇2min,静置分层,如出现乳化现象可滴加甲醇促使

分层。放出三氯甲烷层,经盛有约10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量

慢速滤纸过滤于50 mL蒸发皿中,再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中,重复振摇提

取,三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中,最后用少量三氯甲烷洗过滤器,洗液并于蒸

发皿中。将蒸发皿放在通风柜,于65℃水浴上通风挥干,然后放在冰盒上冷却

23min后,准确加入1mL苯-乙腈混合液(或将三氯甲烷用浓缩蒸馏器减压

吹气蒸干后,准确加入1ml苯-乙睛混合液)。用带橡皮头的滴管的管尖将残

渣充分混合,若有苯的结晶析出,将蒸发皿从冰盒上取出,继续溶解、混合,

晶体即消失,再用此滴管吸取上清液转移于2ml具塞试管中。

    5212乙法(限于玉米、大米、小麦及其制品):称取2000g粉碎过筛

样品于250 mL 具塞锥形瓶中,用滴管吸取约6ml水,使样品湿润,准确加入60 mL

三氯甲烷,振荡 30min•加12 g无水硫酸钠,振摇后,静置30 mIn,用叠成折叠式

的快速定性滤纸过滤于100 ml具塞锥形瓶中。取12ml滤液(相当4g样品)于蒸发

皿中,在65℃水浴上通风挥干,准确加入 l mL苯-乙腈混合液,以下按5211

自“用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合”起,依法操作。

    522花生油、香油、菜油等:称取400 g样品置于小烧杯中,用20 mL正已

烷或石油 醚将样品移于125ml分液漏斗中。用20 mL甲醇水溶液分次洗烧杯,洗液

一并移入分 液漏斗中,振摇2min,静置分层后,将下层甲醇水溶液移人第二个分

液漏斗中,再用5ml甲醇水溶液重复振摇提取一次,提取液一并移人第二个分液漏

斗中,在第二个分液漏斗中加入20 mL三氯甲烷,以下按5211自“振摇2min

静置分层”起,依法操作。

    523酱油、醋:称取1000g样品于小烧杯中,为防止提取时乳化,加04g

氯化钠, 移入分液漏斗中,用15 mL三氯甲烷分次洗涤烧杯,洗液并入分液漏斗

中。以下按 521.自“振摇2min,静置分层”起,依法操作,最后加入25ml

苯•乙睛混合液,此溶液每毫升相当于4g样品。

        或称取1000 g样品,置于分液漏斗中,再加12 ml甲醇(以酱油体积代替水,

故甲醇与水的体积比仍约为5545).用20 mL三氯甲烷提取,以下按5.211

自“振摇2min静置分层”起,依法操作。最后加入25ml-乙睛混合液。此溶

液每毫升相当于4 g样品。

    524干酱类(包括豆鼓、腐乳制品):称取2000g研磨均匀的样品,置

250 mL具 塞锥形瓶中,加入20 mL正己烷或石油醚与50 mL甲醇水溶液。振

30 min,静置片 刻,以叠成折叠式快速定性滤纸过滤,滤液静置分层后,

24 mL甲醇水层(相当8g 样品,其中包括89干酱类本身约含有4ml水的体积

在内)置于分液漏斗中,加入20 mL三氮甲烷,以下按5211自“振摇2min

静置分层”起,依法操作。最后加入2ml -乙睛混合液。此溶液每毫升相当于4g

品。

    525发酵酒类:同523处理方法,但不加氯化钠。

    53测定

    5.31单向展开法

    5311薄层板的制备:称取约3g硅胶G,加相当于硅胶量23倍左右的水,

用力研磨 12min至成糊状后立即倒于涂布器内,推成5cmx20cm,厚度约

025 mm的薄层板三块。在空气中干燥约15min后,在100℃活化2h,取出,放

干燥器中保存。一般可保存3d,若放置时间较长,可再活化后使用。

    5312点样:将薄层板边缘附着的吸附剂刮净,在距薄层板下端3cm的基

线上用微 量注射器或血色素吸管滴加样液。一块板可滴加4个点,点距边缘和点

间距约为1cm,点 直径约3mm在同一板上滴加点的大小应一致,滴加时可用吹

风机用冷风边吹边加。滴加 样式如下:

        第一点:l0μL黄曲霉毒素B1标准使用液(004μg/ml).

        第二点:20μL样液。

        第三点:20μL样液+l0μL004μg/mL黄曲霉毒素Β1标准使用液。

        第四点:20μL样液+10μL02μg/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。

    5313展开与观察:在展开槽内加10 mL无水乙醚,预展12 cm,取出挥干。

再于另一 展开槽内加10 mL丙酮-三氯甲烷(892),展开1012cm,取出。

在紫外光下观察结果,方法如下。

    53131由于样液点上加滴黄曲霉毒素B1标准使用液,可使黄曲霉毒

B1标准点与样液中的黄曲霉毒素B1荧光点重叠。如样液为阴性,薄层板上的

第三点中黄曲霉毒素B10.0004μg,可用作检查在佯液内黄曲霉毒素B1最低硷出

量是否正常出现;如为阳性,则起定性作用。簿层板上的第四点中黄曲霉毒

B10002μ,主要起定位作用。

5.3.1.3.2若第二点在与黄曲霉毒素B1标准点的相应位置上无蓝紫色荧光点,表示

样品中黄曲霉毒素B1含量在5μgkg以下;如在相应位置上有蓝紫色荧光点,

则需进行确证试验。

5.3.1.4确证试验:为了证实薄层板上样液荧光系由黄曲霉毒素B1产生的,加滴三

氟乙酸,产生黄曲霉毒素B1的衍生物,展开后此衍生物的比移值约在01左右。

于薄层板左边依次滴加两个点。

        第一点:10μL004μg/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。

        第二点:20μL样液。

        于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上,反应5min后,用吹风机吹热风2min

       后,使热风吹到薄层板上的温度不高于40℃。再于薄层板上滴加以下两个点。

      第三点:10μL004μgmL黄曲霉毒素B1标准使用液。

      第四点:20μL样液。

      再展开(同5313),在紫外光灯下观察样液是否产生与黄曲霉毒素B1

准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点,可依次作为样液与标准的衍生

物空白对照。

5.3.1.5稀释定量:样液中的黄曲霉毒素B1荧光点的荧光强度如与黄曲霉毒素B1

准点的最低检出量(0.004μg的荧光强度一致,则样品中黄曲霉毒素B1含量即

5μgkg。如样液中荧光强度比最低检出量强,则根据其强度估计减少滴加

微升数或将样液稀释后再滴加不同微升数,直至样液点的荧光强度与最低检出

量的荧光强度一致为止。滴加式样如下:

      第一点:10μL黄曲霉毒素B1标准使用液(004μg/mL)。

      第二点:根据情况滴加10 μL样液。

      第三点:根据情况滴加15μL样液。

      第四点:根据情况滴加20 μL样液。5.3.1.4确证试验:为了证实薄层板上样液荧光系由黄曲霉毒素B1产生的,加滴三

氟乙酸,产生黄曲霉毒素B1的衍生物,展开后此衍生物的比移值约在01左右。

于薄层板左边依次滴加两个点。

        第一点:10μL004μg/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。

        第二点:20μL样液。

      于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上,反应5min后,用吹风机吹热风2min

    后,使热风吹到薄层板上的温度不高于40℃。再于薄层板上滴加以下两个点。

      第三点:10μL004μgmL黄曲霉毒素B1标准使用液。

      第四点:20μL样液。

      再展开(同5313),在紫外光灯下观察样液是否产生与黄曲霉毒素B1

准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点,可依次作为样液与标准的衍生

物空白对照。

5.3.1.5稀释定量:样液中的黄曲霉毒素B1荧光点的荧光强度如与黄曲霉毒素B1

准点的最低检出量(0.004μg的荧光强度一致,则样品中黄曲霉毒素B1含量即

5μgkg。如样液中荧光强度比最低检出量强,则根据其强度估计减少滴加

微升数或将样液稀释后再滴加不同微升数,直至样液点的荧光强度与最低检出

量的荧光强度一致为止。滴加式样如下:

      第一点:10μL黄曲霉毒素B1标准使用液(004μg/mL)。

      第二点:根据情况滴加10 μL样液。

      第三点:根据情况滴加15μL样液。

      第四点:根据情况滴加20 μL样液。

    5316计算

                      V1×D    1000

        X20.0004×-----------×----------…………………(4)

                        V2        M1

式中:X2——样品中黄曲霉毒素8的含量,μgkg

            V1——加入苯-乙腈混合液的体积,mL

           V2——出现最低荧光时而加样液的体积,mL

            D——样液的总稀释倍数;   ”

           M1一加人苯-乙睛混合液溶解时相当样品的质量,g;

           00004——黄曲霉毒素B1的最低检出量,μg

      结果的表述:报告测定值的整数位。

   532双向展开法

      如用单向展开法展开后,薄层色谱由于杂质干扰掩盖了黄曲霉毒素B1的荧

光强度,需采用双向展开法。薄层板先用无水乙醚作横向展开,将干扰的杂质

展至样液点的一边而黄曲霉毒素B1不动,然后再用丙酮,三氯甲烷(892)作

纵向展开,样品在黄曲霉毒素B1相应处的杂质底色大量减少,因而提高了方法

灵敏度。如用双向展开中滴加两点法展开仍有杂质干扰时,则可改用摘加-点法。

    5321滴加两点法

    53211点样:取薄层板三块,在距下端3cm基线上滴加黄曲霉毒素B1

准使用液与样液。即在三块板的距左边缘081cm处各滴加10μL黄曲霉毒素B1

标准使用液(004μg/mL),在距左边缘2.83cm处各滴加20μL样液,然后在

第二块板的样液点上加滴10μL黄曲霉毒素B1标准使用液(004μg/mL),在第

三块板的样液点上加滴10μL02μg/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。

    53212展开

    532121横向展开:在展开槽内的长边置一玻璃支架,加10 mL无水

乙醇,将上述点好的薄层板靠标准点的长边置于展开槽内展开,展至板端后,

取出挥干,或根据情况需要时可再重复展开12次。

    532122纵向展开:挥干的薄层板以丙酮-三氯甲烷(892)展

开至1012 cm为止。丙酮-三氯甲烷的比例根据不同条件自行调节。

    53213观察及评定结果

    532131在紫外光灯下观察第一、二板,若第二板的第二点在黄曲霉

毒素B1标准点的相应处出现最低检出量,而第一板在与第二板的相同位置上未

出现荧光点,则样品中黄曲霉毒素B1含量在5μgkg以下。

    532132若第一板在与第二板的相同位置上出现荧光点,则将第一板

与第三板比较,看第三板上第二点与第一板上第二点的相同位置上的荧光点是否

与黄曲霉毒素B1标准点重叠,如果重叠,再进行确证试验。在具体测定中,第

一、二、三板可以同时做,也可按照顺序做。如按顺序做,当在第一板出现阴

性时,第三板可以省略,如第一板为阳性,则第 二扳可以省略,直接作第三板。

    53214确证试验:另取薄层板两块,于第四、第五两板距左边缘

081cm处各滴 加10μL黄曲霉毒素B1标准使用液(004μg/mL)及1小滴

三氟乙酸;在距左边缘28一 3cm处,于第四板滴加20 μL样液及1小滴三氟

乙酸;于第五板滴加20μL样液、10μL黄曲霉毒素B1标准使用液(004μg/mL

1小滴三氟乙酸,反应5min后,用吹风机 吹热风2min,使热风吹到簿层板上的

温度不高于40.再用双向展开法展开后,观察样 液是否产生与黄曲霉毒素B1

准点重叠的衍生物。观察时,可将第一板作为样液的衍生物 空白板。如样液黄

曲霉毒素B1含量高时,则将样液稀释后,按5314做确证试验。

    53215稀释定量:如样液黄曲霉毒素B1含量高时.按5315

释定量操作。如黄曲 霉毒素B1含量低,稀释倍数小,在定量的纵向展开板上仍

有杂质干扰,影响结果的判断,可将样液再做双向展开法测定,以确定含量。

    53216计算:同531.6

    5322滴加一点法

    53221点样:取薄层板三块,在距下端3cm基线上滴加黄曲霉毒素B1

准使用液与样液。即在三块板距左边缘081cm处各滴加20 μL样液,在第二

板的点上加滴 10 μL黄曲霉毒素B1标准使用液(004μg/mL),在第三板的点

上加滴10μL黄曲霉毒素B1标准溶液(02μg/mL)。

    53222展开:同53212的横向展开与纵向展开。

    53223观察及评定结果:在紫外光灯下观察第一、二板,如第二板出

现最低检出量 的黄曲霉毒素B1标准点,而第一板与其相同位置上未出现荧光点,

样品中黄曲霉毒素B1含 量在5μg/kg以下。如第一板在与第二板黄曲霉毒素B1

同位置上出现荧光点,则将第 一板与第三板比较,看第三板上与第一板相同位置

的荧光点是否与黄曲霉毒素B1标准点 重叠,如果重叠再进行以下确证试验.

    53224确证试验:另取两板,于距左边缘081cm处。第四板滴加

20 μL样液、l滴三氟乙酸;第五板滴加20μL样液、10μL 004μg/mL黄曲霉毒

B1标准使 用液及1滴三氟乙酸产生衍生物及展开方法同5.3214。再将以

上二板在紫外光灯下 观察,以确定样液点是否产生与黄曲霉毒素B1标准点重叠

的衍生物,观察时可将第一板作 为样液的衍生物空白板。经过以上确证试验定

为阳性后,再进行稀释定量,如含黄曲霉毒 素B1低,不需稀释或稀释倍数小,

杂质荧光仍有严重于扰,可根据样液中黄曲霉毒素B1荧光 的强弱,直接用双向

展开法定量。

    53225计算:同5316

 

                                                      第二篇  第二法

      6 原理

        样品中的黄曲霉毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应,多

余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合,加入酶标记物和底物后显色,与标

准比较来测定含量。

    7试剂

    71抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体,由卫生部食品卫生监督检验所进行质量控制。

    72人工抗原: AFB一牛血清白蛋白结合物。

    73黄曲霉毒素B1标准溶液。

    731黄曲霉毒素B1标准溶液的制备:用甲醇将黄曲霉毒素B1配制成1mg/mL

溶液,再用甲醇-pBs溶液(2080)稀释至约10 μg/mL,紫外分光光度计测此溶

液最大吸收峰的 光密度值,代人式(5)计算:

                 A×M×1000×F

              X---------------------------------  …………………………………(5

                         E

        式中:X一一该溶液中黄曲霉毒素B1的浓度,μg/mL

                    A——测得的光密度值;

                   M一一黄曲霉毒素B1的分子量312

                   E一一摩尔消光系数, 21800

                   f——使用仪器的校正因素。

                  根据计算将该溶液配制成10 μg/mL标准溶液,检测时,用甲醇-pBS

溶液将该标准溶液稀释至所需浓度。

        74  三氯甲烷。

        75  甲醇。

        76  石油醚。

        77  牛血清白蛋白(BSA)。

        78  邻苯二胺(0P0)。

        79  辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠lgG

        7. 10  碳酸钠。

        7. ll  碳酸氢钠。

        7. 12  磷酸二氢钾。

    7. 13  磷酸氢二钠。

    714   氯化钠。

    715   氯化钾。

    716过氧化氢(H2o2)。

    717硫酸。

    718 ELISA缓冲液。

    7181包被缓冲液(PH96碳酸盐缓冲液)的制备:

            Na2CO3  159g

                    NaHcO3   293g

            加蒸馏水至1000ml

    7182磷酸盐缓冲液(pH74 PBS)的制备:

                KH2po4       02g

            Na2HPo4 12H2o     2.9g

            NaC1           80g

            KcI            02g

            加蒸馏水至1000m

    7183洗液(PBS-T)的制备: pBS005vV)吐温-20

   7.18.4抗体稀释液的制备:BsA  10gPBsT1000mL

    7. 185底物缓冲液的制备。

71851   A 液(0.1MoLL柠檬酸水溶液):柠檬酸(c6H8o7H2) 2101g

加蒸馏水至1000 mL

71852   B液(02Mol/L磷酸氢二钠水溶液): Na2HPo4 12H2o  716g

加蒸馏水至1000mL

71853用前按A液+B液+蒸馏水为24.325750的比例(体积比)配制。

7186封闭液的制备:同抗体稀释液。

8仪器

    81小型粉碎机。

    82电动振荡器。

    83酶标仪,内置4g0 nm滤光片。

    84恒温水浴锅。

    85恒温培养箱。

    85酶标微孔板。

      87  微量加样器及配套吸头

      9   分析步骤、

      91  取样,同51

      92  提取

      92大米和小米(脂肪含量小于300%)的提取(脂肪含量参照《食物

成分表》,中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所编著, 19918月,第一版)

          样品粉碎后过20目筛,称取200g,加入250 mL具塞锥形瓶中。准确加

60 mL 三氯甲烷,盖塞后滴水封严。150r/min振荡30 min.静置后,用快速定性

滤纸过滤于 50 mL烧杯中。立即取12mL滤液(相当40g样品)于75 mL蒸发皿

中, 65℃水浴通风、 挥干。用20ml 20%甲醇-pBS分三次(08mL07mL

05mL)溶解并彻底冲洗蒸发皿中 凝结物,移至小试管,加盖振荡后静置待测。

此液每毫升相当于20g样品。

    922玉米的提取(脂肪含量30%50%

        样品粉碎后过20目筛,称取20Og,加入250 mL具塞锥形瓶中,准确加

入 500 mL甲醇一水(8020)溶液和150mL石油醚,盖塞后滴水封严。

150r/min振荡30 min用快速定性滤纸过滤于125 mL分液漏斗中。待分层后,放

出下层甲醇-水溶液于 50 mL烧杯中,从中取100 mL(相当于4.0g样品)

75 mL蒸发皿中。以下按921  自“65℃水浴通风挥干”起,依法操作。

    923花生的提取(脂肪含量150%450%)

        样品去壳去皮粉碎后称取20g.加入250 mL具塞三角瓶中,准确加

100.0 mL甲醇一水(5545)溶液和30 mL石油醚。盖塞后滴水封严。150r/min

振荡30 min。静 置15 min后用快速定性滤纸过滤于125 mL分液漏斗中。待分

层后,放出下层甲醇。水 溶液于100mL烧杯中,从中取200 mL(相当于40g

样品)置于另一125mL分液漏斗中,加入 200 mL三氯甲烷,振摇2min,静置

分层(如有乳化现象可滴加甲醇促使分层)。放出三氯甲烷于75 mL蒸发皿中。

再加50 mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后,放出三氯甲烷一并于蒸发

皿中,以下按921自“65℃水浴通风挥干”起,依法操作。

    924植物油的提取

        用小烧杯称取40g样品,用200 mL石油醚,将样品移于125 mL分液漏斗

    中,用200mL甲醇-水(5545)溶液分次洗烧杯,溶液一并移于分液漏斗中(

精炼油 40g样为4525 mL,直接用移液器加入分液漏斗,再加溶剂后振摇)振

2min。静置分层后,放出下层甲醇-水溶液于75 mL蒸发皿中,再用50 mL

醇,水溶液重复振摇提取一次,提取液一并加入蒸发皿中,以下按921

65℃水浴通风挥干”起,依法操作。

      925   其他食品的提取

      可按第一法5211523524操作至“将蒸发皿放在通风柜

内于65℃水浴上通风挥干”,以下接921“用20mL  20%甲醇-PBS分三

次”起,依法操作。

    93间接竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA).

    931包被微孔板:用AFB1-BsA人工抗原包被酶标板,150μg/孔,4℃过夜。

    932抗体抗原反应:将黄曲霉毒素B1纯化单克隆抗体稀释倍后分别

      a•与等量不同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液用2mL试管混合振荡后,4℃静置。

此液用于制作黄曲霉毒素B1标准抑制曲线。

      b•与等量样品提取液用2mL试管混合振荡后,4℃静置。此液用于测定样品

中黄曲霉毒素B1含量。

933封闭:已包被的酶标板用洗液洗3次,每次3min后,加封闭液封闭,

 250μL孔,置37℃下1h。                 。

9.3.4测定:酶标板洗3×3min后,加抗体抗原反应液(在酶标板的适当孔位加

抗体稀释液或SP2o。培养上清液作为阴性对照)130μL/孔,37℃,2h。酶

标板洗3x3min,加酶标二抗(1200VV100μL/孔,1h。酶标板用洗液洗

5x3min。加底物溶液(10mgopd,25mL,底物缓冲液加37μL/孔,30H2O2

100μL/孔,37℃,15min,然后加2molL H2So4,40μL/孔,以终止显色反

应,酶标仪490nm测出OD值。

    94计算

                            v1                 1

    黄曲霉毒素浓度(ng/g)=C×-------------×D×---------  ……………(6)

                            v2                 M2

式中:C一黄曲霉毒素B1量,ng,对应标准曲线按数值插入法求得;

            V1——样品提取液的体积,mL;

            V2——滴加样液的体积,mL

             D一一一烯释倍数;

            M2一一样品质量,g

    由于按标准曲线直接求得的黄曲霉毒素浓度(C1)的单位加ng/mL,而测孔中

加入的样品提取的体积为0065 mL,所以式(6)中

                                          c0065mLXC1

    而V12mL,V2=0.065mLD=2,m2=4g,代人式(6),则

                                                                                                2             1

   黄曲霉毒素B1浓度(ng/g=0.065×C1×------------×2×--------=C1(ng/g)………(7)

                                           0.065          4

    所以,在对样品提取完全按本方法进行时,从标准曲线直接求得的数值C1,即

为所测样品中黄曲霉毒素B1的浓度(ng/g)。

 

                 -----------------------------------------------------------------------------------

 

      附加说明:

      本标准由卫生部卫生监督司提出。

    本标准第一法由中国预防医学科学院营养及食品卫生研究所、中华人民共和国

青岛进出口商品检验局负责起草;第二法由卫生部食品卫生监督检验所、北京市

营养源研究所负责起草。

    本标准由卫生部委托技术归日单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。